Евгений Евстигнеев родился 9 октября 1926 года в городе Канавине, (сейчас в составе Нижнего Новгорода). Его родители работали на заводе: отец — металлургом, а мать — фрезеровщицей. Отец Евгения умер, когда мальчику было шесть лет.

Будущий артист окончил школу-семилетку. Затем работал электромонтёром, учился в дизелестроительном техникуме, а после устроился слесарем на завод. В свободное время он играл на барабанах, гитаре и балалайке в самодеятельном ансамбле.

Директор Горьковского театрального училища Виталий Лебский предложил джазмену-самоучке получить актёрское образование. Ради Евстигнеева сделали исключение: его приняли уже после основного набора, без полного среднего образования и без экзаменов.

Артист выпустился из училища в 1951 году и по распределению попал во Владимирский областной театр имени Луначарского. Здесь его заметил ректор Школы-студии МХАТ Вениамин Радомысленский. По его совету Евгений Евстигнеев отправился в Москву и продолжил учиться. Его взяли сразу на третий курс МХАТа в мастерскую Павла Массальского. Среди одноклассников 28-летнего артиста были Татьяна Доронина, Олег Басилашвили, Михаил Козаков и Виктор Сергачёв.

Евгений Евстигнеев вместе с Олегом Ефремовым, Галиной Волчек, Олегом Табаковым, Игорем Квашой был в числе выпускников школы-студии, которые организовали Студию молодых актёров. Вскоре она получила название «Современник». Евстигнеев играл в первом спектакле площадки по пьесе Виктора Розова «Вечно живые». Также среди его работ — роли в постановках «Голый король», «Пять вечеров», «Обыкновенная история», «Чайка», «На дне».

В 1971 году, когда Олег Ефремов возглавил МХАТ, Евстигнеев также присоединился к труппе этого театра. Здесь артист играл в спектаклях «Валентин и Валентина», «Эшелон», «Мы, нижеподписавшиеся», «Дядя Ваня» и многих других.

У Евгения Евстигнеева была не очень хорошая память — при этом он был известен искромётным чувством юмора. Забывая слова, он ярко импровизировал. Однажды в спектакле «На дне» Евстигнеев пропустил почти весь монолог своего героя Сатина и выдал лишь ключевую фразу «Человек — это звучит гордо!». Это «авторское прочтение» произвело большое впечатление на польского режиссёра Анджея Вайду, который был в зале.

Евгений Евстигнеев снимался в кино с 1957 года. Он играл в таких фильмах, как «Баллада о солдате», «Девять дней одного года» и многих других, а всесоюзной знаменитостью стал в роли руководителя пионерлагеря Дынина в комедии «Добро пожаловать, или Посторонним вход воспрещён». После были яркие образы в фильмах «Берегись автомобиля», «Золотой телёнок», «Старики-разбойники», «Мы из джаза». Также кинематографисты охотно давали актёру роли интеллигентов: профессора Плейшнера из «Семнадцати мгновений весны», Корзухина из «Бега» и, конечно, Преображенского в «Собачьем сердце».

В 1983 году Евгений Евстигнеев стал народным артистом СССР. Он активно снимался и играл на сцене. Но жизнь актёра омрачали проблемы с сердцем. Также он пережил личную трагедию: смерть второй супруги. В 1988 году Евстигнеев обратился к худруку МХАТ Олегу Ефремову с просьбой снизить нагрузку. Ефремов в ответ предложил артисту уйти на пенсию.

Евгений Евстигнеев был женат трижды. Первой его супругой стала Галина Волчек. Они познакомились во время учёбы в школе-студии МХАТ. Волчек также была в числе основателей «Современника». У пары родился сын Денис. Супруги прожили в браке девять лет.

Второй женой Евстигнеева стала актриса Лилия Журкина. Она тоже окончила Школу-студию МХАТ и пришла в «Современник» в 1963 году. Вскоре между актёрами завязался тайный роман. Однако на гастролях труппы в Саратове всё раскрылось. Галина Волчек приняла решение разойтись с супругом, а Журкиной из-за скандала пришлось покинуть театр.

Более того, молодая актриса на тот момент также была замужем — за скульптором Олегом Иконниковым. Он долгое время препятствовал разводу. Однако в конечном итоге Евстигнеев и Журкина поженились, а в 1968 году у пары родилась дочь Мария. 

Лилия Журкина иногда играла небольшие роли в кино, в основном в тех фильмах, где снимался Евстигнеев. В 1975 году её также приняли в МХАТ, но и здесь работы было мало. Актриса тяжело переживала ситуацию, просила мужа замолвить за неё словечко перед Ефремовым, но Евстигнеев был непреклонен.

Отношения между супругами были сложными, кроме того — Журкина страдала от тяжёлой болезни. Иногда актриса пыталась облегчить состояние с помощью алкоголя. Лилия Журкина скончалась в 1986 году, ей было 48 лет.

Мария Евстигнеева окончила Школу-студию МХАТ в 1987 году. Сейчас она служит в театре «Современник». Выйдя замуж, она взяла фамилию супруга — Селянская, поскольку хотела строить карьеру самостоятельно, а не за счёт громкого имени отца.

Евстигнеев женился в третий раз — на актрисе Ирине Цывиной. Она училась в Школе-студии МХАТ, где артист на тот момент преподавал. Третья супруга была на 37 лет младше Евгения Евстигнеева и на пять лет старше его дочери. Мария сначала не одобрила стремление отца строить новые отношения, но позже помирилась с мачехой. Ирина Цывина оставалась с Евгением Евстигнеевым до конца его дней.

У артиста были серьёзные проблемы с сердцем. Он дважды перенёс инфаркт. В марте 1992 года ему должны были делать операцию на сердце в Лондоне — поездку помог организовать бывший министр культуры СССР Николай Губенко. Шансы на успех были невысоки, о чём Евстигнеева предупредил врач.

Как вспоминала Мария Селянская, «он был гениальным актёром и представил себе на секунду, как это бывает — смерть. А потом просто не смог вернуться».

Евстигнеев скончался от обширного инфаркта 4 марта 1992 года в Лондоне. Артисту было 65 лет. Похоронили Евстигнеева на Новодевичьем кладбище в Москве.